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『支原體檢測方法』到底應該怎樣選?

更新時間:2023-04-15  |  點擊率:728

生物醫(yī)藥與支原體檢測

在疫苗、生物藥、細胞治療領域等領域,支原體檢測發(fā)揮著重要作用,該項檢測是檢查藥物是否遭受外源因子污染的有效手段,是保證產品質量的重要質控途徑。

我國藥典中有提到,在一些領域需要進行支原體檢測。包括主細胞庫、工作細胞庫、生產終末細胞、檢定細胞、病毒種子批和病毒收獲液、細胞培養(yǎng)相關材料如培養(yǎng)基、胰酶、臨床治療用干細胞和免疫細胞、新生牛血清以及雜交瘤細胞等。

常見的支原體檢測方法有以下幾種:

  • 培養(yǎng)法

  • 指示細胞法

  • 核酸法

  • ELISA法

琳瑯滿目的檢測方法這么多,究竟該怎么選?本期內容盤點了幾種常見的支原體檢測方法,希望能幫助小伙伴們選擇適合自己的方法。


方法一:分離培養(yǎng)法

方法

簡單來講,就是從樣品細胞培養(yǎng)體系中取樣,接種到適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會在這種瓊脂平板上生長,最終形成明顯可見的特征性菌落。

優(yōu)點

操作規(guī)范的情況下,這種方法很少會出現(xiàn)假陰性結果,檢測精確度很高,因此被譽為支原體檢測金標準。

該方法也是《美國藥典》中認可的支原體檢測方法之一。

缺點

檢測時間太長,支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。

還有一點就是,培養(yǎng)法無法對曾經感染過的樣品做出判斷。

另一方面,盡管可以檢測絕大多數支原體種類,分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候,例如支原體M. Hyorhinis。因此,該方法能鑒定的支原體種類有限,成為它的另一個缺點。


方法二:指示細胞法

方法

將供試品接種于指示細胞(無污染標準化Vero 細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞,供試品應對該細胞生長無影響)中培養(yǎng)后,用特異熒光染料進行染色,支原體中的核酸也可以被著色。

因此,如果待檢測細胞中含有支原體,那么就會導致指示細胞被感染,進而在細胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍色熒光(支原體附著在細胞膜上,也有可能游離在細胞培養(yǎng)基中)。

優(yōu)點

適用于一些不易培養(yǎng)的支原體,如豬鼻支原體,分離培養(yǎng)法對該支原體檢測并不可靠,但可用DNA染色法準確地檢測出來。屬于《美國藥典》中認可的方法。

缺點

時間較長,從Vero細胞復蘇、傳代,再到收集上清后再次培養(yǎng),有時甚至需要十幾天時間

存在假陽性和假陰性的可能:如一些死亡細胞釋放出來的DNA會被染成藍色,出現(xiàn)假陽性;或是由于熒光過若而出現(xiàn)假陰性使結果出現(xiàn)偏差,因此使用這個方法需要一定的經驗。


方法三:核酸法

方法

通過對樣品中可能存在的支原體DNA進行擴增并檢測,來判斷樣品是否被支原體污染。常用的核酸法主要有常規(guī)PCR法和熒光定量PCR法(qPCR),德國MB均有針對這兩種方法設計的高效試劑盒。






優(yōu)點

目前使用較為廣泛,擁有檢測速度快、高特異性、高靈敏度等特點,還可以選配支原體和細菌DNA、支原體絕對定量標準品,來進行特異性驗證、定量檢測。

《美國藥典》中指出,核酸法經過方法學驗證,可替代培養(yǎng)法以及指示細胞法這兩種經典方法。

缺點

qPCR的檢測試劑盒成本相對較高。

總結

在選擇支原體檢測方法時,應從實際的應用場景出發(fā)。


如果只是想判斷樣品是否被支原體污染,無需出具報告等專業(yè)說明,使用德國MB的常規(guī)PCR檢測試劑盒即可。





如果是疫苗、生物藥等產品的上市前檢測,需要出具專業(yè)的報告,則需要用到德國MB的qPCR支原體檢測試劑盒,同時配套使用標準品,完成方法學驗證,為了提高準確性和靈敏度,建議配合支原體DNA提取試劑盒一起使用。




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